今回私たちは、ECAT遺伝子群の中のECAT15-1/Dppa4とECAT15-2/Dppa2という相同性を有する二つの遺伝子に着目しました。ECAT15-1とECAT15-2は、同じ染色体上非常に近傍に位置し、共にDNA結合ドメインであるSAPモチーフを有するタンパク質を発現します。これら二つの遺伝子の、生体内における機能や二遺伝子間の関係を調べるため、ECAT15-1KOマウス（ECAT15-1ノックアウトマウス）とECAT15-2KOマウス、さらにECAT15-1/15-2ダブルKOマウスを作製しました。ECAT15-1とECAT15-2が初期胚で高発現することから、これら3系統のKOマウスは初期胚で異常を示すと予想しましたが、驚くべきことに出生前後の肺で異常を示し、高い致死率を示すことが明らかになりました。さらに興味深いことに、ECAT15-2KOマウスはECAT15-1/15-2ダブルKOマウスよりも重篤な表現型を示しました。また、KOマウスの表現型が肺で見られたことから、ECAT15-1とECAT15-2も肺で発現が見られるのではないかと考え、様々な方法で発現の検出を試みましたが、発現は認められませんでした。

発現が見られない組織においてKOマウスの表現型が現れるのはなぜか？私たちは、SAPモチーフをもつタンパク質の中にはエピジェネティクス制御に関与する遺伝子が見つかっていること、また、ECAT15-1とECAT15-2は初期胚で高発現していることから、ECAT15-1とECAT15-2は初期胚において何らかのエピジェネティクス制御を担っており、その影響が発現消失後の肺で現れるのではないかと考えました。この仮説を検証するために、初期胚のin vitroモデルとしてECAT15-2KO ES細胞を樹立し解析したところ、ECAT15-2KOマウスの肺で異常発現を示す遺伝子の領域が、ECAT15-2KO ES細胞ではエピジェネティック修飾の異常が認められました。また、それらの遺伝子領域の中にはECAT15-2が直接結合している領域も見つかりました。さらにECAT15-1とECAT15-2はES細胞の中でタンパク質間相互作用を示すことも明らかになりました。

以上のことから、ECAT15-1とECAT15-2を含むタンパク質複合体が、初期胚においてエピジェネティクス制御をし、時間・空間的に離れた肺の発生に影響することが示されました。

図1／Figure 1

ECAT15-1/Dppa4とECAT15-2/Dppa2の遺伝子構造。ECAT15-1とECAT15-2は16番染色体上に約17kbp離れて位置し、どちらもエキソン7個からなる。そこから発現するタンパク質は約32%の相同性を有し、共にSAPモチーフというDNA結合ドメインを持つ。 Gene structure of ECAT15-1/Dppa4 and ECAT15-2/Dppa2. ECAT15-1 and ECAT15-2 are located on chromosome 16th tandemly, and have same exon number seven. The encoded products show about 32% identity, and have same DNA binding domain, SAP motif.

図2／Figure 2

ECAT15-1KOマウス、ECAT15-2KOマウス、ECAT15-1/15-2ダブルKOマウスの肺組織像。ECAT15-2KOマウス肺が最も重篤な表現型を示し、ECAT15-1/15-2ダブルKOマウス肺は個体間に重篤度の差が見られた。 Histological analysis of ECAT15-1KO, ECAT15-2KO and ECAT15-1/15-2 double KO lung. ECAT15-2KO lung shows the severest phenotype among three mutants. On the other hand, ECAT15-1/15-2 double KO mutants have diversities of severity.

そこで、臨床応用に使用できるiPS細胞を効率よく作製する方法の確立のために、より安全でより効率の良い新規初期化因子の探索を行ってきました。その過程で、1,437個の転写因子をスクリーニングし、Klf4の代替因子として新規に18因子を同定しました。いずれの因子もKlf4代替因子としての誘導効率は低かったのですが、その18因子の1つである転写因子Glis1を、3因子(Oct3/4, Sox2, Klf4)あるいは4因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)と一緒に、マウスまたはヒトの線維芽細胞に導入すると、いずれにおいても非常に効率よくiPS細胞を作製できることを見出しました。Glis1は未授精卵や受精卵1細胞期で高度に発現している転写因子です。

さらに、Glis1は初期化が不完全な細胞の増殖を抑制し、完全に初期化した細胞のみ増殖することを明らかにしました。また、Glis1が初期化を促進する機構についても詳細な解析を行い、Glis1は初期化誘導に寄与することが報告されている複数の遺伝子の発現を上昇させることによって初期化を促進していることもわかりました。

これらの結果は、Glis1を用いることにより、安全性の高いiPS細胞を効率よく作製できる可能性を示しており、臨床応用に使用可能なiPS細胞作製方法の確立に大きく貢献することが期待されます。

図１　GFP陽性コロニー数。Glis1はc-Mycと同等に、またGlis1はc-Mycと相乗的にGFP陽性コロニーを増殖させる。 Figure 1　 Number of Nanog–GFP-positive colonies from mouse skin fibroblasts.

図2　GFP陽性コロニーの割合。Glis1で誘導されたコロニーはほとんどがGFP陽性。 Figure 2　 Proportion of Nanog–GFP-positive colonies to total number of colonies.

図3　Oct3/4, Sox2, Klf4, Glis1を導入して作製されたiPS細胞由来の奇形腫。左から、神経細胞、軟骨、円柱上皮。 Figure 3　 iPSCs generated by OSK+GLIS1 were subcutaneously transplanted into nude mice and teratomas were analysed histologically with haematoxylin and eosin staining.

図4　 Oct3/4, Sox2, Klf4, Glis1を用いて樹立されたiPS細胞由来のキメラマウス（上）。F1の体毛色から生殖系譜への寄与が確認された（下）。 Figure 4　 Upper panel: chimaeric mouse derived from iPSCs obtained by transfection of MEFs with OSK+GLIS1. Lower panel: coat colour of offspring, showing germline transmission.

今回、私たちはプラスミドに様々な遺伝子を組み合わせて入れることで、ヒトiPS細胞の作製効率を改良することに成功しました。樹立したiPS細胞の大多数にはプラスミドの挿入は認められませんでした。また、神経細胞や軟骨など多様な組織への分化能力を持つことも確認しました。

臓器移植の際などに、免疫拒絶反応を引き起こす因子の一つにHLAがあります。特にHLA-A, BおよびDRの3座の型が適合することが免疫拒絶反応の抑制に重要であることが分かっています。私たちは約20%の日本人への移植適合性があるHLA3座を持つヒト歯髄細胞2株からも、新しく開発した方法でiPS細胞を作製しました。また、試算を行ったところ特殊なHLA型を持つiPS細胞が50株得られれば、70%を超える日本人に移植適合性があることが分かりました。3座の適合のみで免疫拒絶反応を完全に抑制できる訳ではありませんが、今回の研究は将来iPS細胞バンクを作る上で非常に有用な知見だと考えられます。

図１導入因子によるiPS細胞樹立効率の違い。 Figure 1 Numbers of iPS colonies obtained with different combinations of reprogramming factors.

図2 iPS細胞から作製された神経細胞。 Figure 2 Differentiation of iPS cells into dopaminergic neurons.

図3 特殊なHLA型のiPS細胞による日本人への移植適合率。 Figure 3 Estimated cumulative coverage of the Japanese population by theoretical unique HLA homozygous donors at HLA-A, HLA-B and HLA-DRB1 loci with four-digit specification.

そこでES細胞の分化多能性に非常に重要な働きをする遺伝子であるNanogの発現を指標とし、再度検討を行なった。Nanogレポーターマウスの胎仔線維芽細胞に前述の4つの遺伝子を導入し、レポーターの発現を指標としてNanog-iPS細胞の樹立に成功した。この細胞はNanog、ERasやEsg1などのES細胞のマーカー遺伝子を発現しており、マイクロアレイを用いた網羅的な解析から約90％の遺伝子の発現がES細胞と同程度であることが分かった。

分化能についても、初期胚に移植を行うことにより複数のクローンからキメラマウスが誕生した。このうち一部からは子孫も産まれてきており、Nanog-iPS細胞はES細胞に匹敵する分化能力を有していることが示された（図１）。

ところが、キメラマウスとその子孫の約20％に腫瘍ができることが判明した。Nanog-iPS細胞のゲノムには樹立段階で用いたレトロウイルスによって、原癌遺伝子であるc-Mycを含む４つの外来遺伝子が10コピー以上も挿入されていた。詳細な解析の結果、このc-Mycの再活性化が腫瘍形成の一因だと考えられた。以上の結果より、体細胞からES細胞に匹敵する分化能力を持つiPS細胞を作り出せることが明らかとなったが、医療への応用にはレトロウイルスを用いた方法を改善する必要がある。

Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 126:663-676, 2006.

Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 448, 313-317.

Mouse iPS cells

マウスiPS細胞からできたネズミ。茶色い毛がiPS細胞由来である事を示しています。 Germline chimera mice from mouse iPS cells.

ヒトES細胞のマーカーであるSSEAs、TRAsやNANOGを発現していた。他にも、増殖、テロメラーゼ活性、遺伝子発現、エピジェネティック状態などがES細胞と類似していた。ヒトiPS細胞は胚様体や奇形腫形成により三胚葉系に分化することができた。さらにこれまでに確立された手法を用いて高効率にドーパミン産生ニューロンや心筋細胞への直接的な分化誘導を行うことができた。

以上の結果より、マウスだけでなくヒト細胞でも既知因子を導入することによりiPS細胞を樹立できることが明らかとなった。

Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S. (2007b). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872.

Human iPS cells

ヒト成人皮膚細胞から樹立したiPS細胞。 Human iPS cells derived from adult human dermal fibroblasts.

しかしながら、iPS細胞樹立に用いたレトロウイルス由来のc-Myc遺伝子の再活性化によりキメラマウスやその子孫マウスに腫瘍が発生することが分かり、再生医療へ用いるには安全面での問題が考えられた。我々はiPS細胞作製の条件を改良することでレトロウイルスのc-Mycを用いず３因子だけでマウス繊維芽細胞からMyc-（マイナス）iPS細胞を樹立することに成功した。

このMyc- iPS細胞は成体キメラマウスを作ることができた（図３）。これらのキメラマウスからは現在のところ腫瘍の形成は認められていない。さらに、ヒトの細胞からも同様にMyc- iPS細胞を樹立することに成功した。これらの成果はiPS細胞の再生医療への応用に向け重要な知見であると考える。

Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Takahashi, K., Ichisaka, T., Aoi, T., Okita, K., Mochiduki, Y., Takizawa, N., and Yamanaka, S. (2008). Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol 26, 101-106.

Myc-(minus) iPS cells

Myc-（マイナス）iPS細胞由来のキメラマウス（左：マウス胎仔線維芽細胞由来、緑色蛍光（GFP）を発現している。右：成体マウス尻尾線維芽細胞由来。赤色蛍光（DsRed）を発現している。） Chimeric mice obtained by blastcyst injection of Myc- iPS cells derived from mouse embyonic fibroblasts (left: green) or tail-tip fibroblasts (right: red).

また、４因子を用いて作ったiPS-Stm/-Hep細胞を用いて作製したキメラマウスにおいて腫瘍発生率が４因子を用いて作ったMEF由来iPS細胞に比べて低いことが明らかとなった。詳細な解析の結果、iPS-Stm/-Hep細胞においてはレトロウイルスのゲノムへの挿入数が少ないことが分かり、このことが腫瘍発生率が低いことに関係していると考えられる。

Aoi, T., Yae, K., Nakagawa, M., Ichisaka, T., Okita, K., Takahashi, K., Chiba, T., and Yamanaka, S. (2008). Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science 321, 699-702.

iPS-Stm/Hep cells

胃上皮（Stm）や肝臓由来細胞（Hep）に４因子を導入し樹立されたiPS細胞（右）。 Generation of iPS cells from adult mouse hepatocytes and gastric epithelial cells.

Germline transmission of iPS-Stm cells

iPS-Stm細胞を用いた実験で生殖系列への伝承を確認できた。 Germline transmission using iPS-Stm cells stably expressing GFP.

しかし、iPS細胞の元の体細胞のゲノムに体するウイルス遺伝子の挿入（integration）が腫瘍発生のリスクを高めることが分かってきた。この問題を解決するために我々はウイルスを用いずにiPS細胞を樹立できないか研究を行ってきた。その結果、ウイルスを用いずにマウスiPS細胞を樹立することに成功した。

遺伝子工学で広く用いられているプラスミド（plasmid）を工夫し、一つのプラスミドに３つの因子（Oct3/4,Sox2,Klf4）を一緒に入れ込み、別のプラスミドでc-Mycを発現させた。これらのプラスミドをマウス胎仔線維芽細胞に複数回導入（トランスフェクション transfection）したところiPS細胞を樹立することができた。このPlasmid-iPS細胞は多能性を有しており、キメラマウスに寄与できることも確認した。まだマウス胎仔線維芽細胞からしかPlasmid-iPS細胞はできていないが、再生医療への応用に一歩近づいたと考えられる。その後、生殖系列への伝承（germline transmission）も確認された。

Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2008). Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 322, 949-953.

Plasmid-iPS cells

Generation of mouse iPS cells without viral vectors. Nanog-GFP iPS cells were obtained by plasmid transfection. ウイルスを用いず、プラスミドによる因子の導入で樹立されたマウスiPS細胞。iPS細胞の指標となるGFPの発現が確認できた（右）。

Chimera mice derived from plamid-iPS cells

Plasmid-iPS cell-derived chimera mice: contribution of plasmid-iPS cells is detected by agouti coat color. Plasmid-iPS細胞由来のキメラマウス：茶色い毛がplasmid-iPS細胞由来である事を示す。