ジャニン・グラジュカレク大学院生（京都大学CiRA未来生命科学開拓部門）、クヌート・ウォルツェン准教授（京都大学CiRA同部門）らの研究グループは、マギル大学（カナダ）との共同研究で、新たなツール「MHcut」法を開発し、ゲノム編集技術¹⁾と応用させて、ヒトiPS細胞から遺伝子疾患の病態を再現することに成功しました。

　この研究成果は、2019年10月24日（日本時間）に「Nature Communications」でオンライン公開されました。

　DNAは損傷を受けると自然に修復する能力を持っています。これまで、DNAの修復機構は、相同組換え修復（homology directed repair；HDR）²⁾と非相同末端結合（non homologous end joining；NHEJ）³⁾が主に研究されていましたが、本研究グループは第３の修復機構、マイクロホモロジー媒介末端結合(Microhomology-mediated end joining; MMEJ) ⁴⁾に着目し、研究を進めてきました。MMEJはマイクロホモロジーと呼ばれる、DNA切断後の末端部分の短い配列(5〜25塩基対)を認識して修復する機構です。ゲノム編集技術CRISPR/Cas9はHDR、NHEJ、MMEJの３ついずれの機構とも組み合わせて使うことができますが、これまでの研究で、MMEJは他の２つに比べ、より正確にゲノム編集できることが分かってきていました。

　研究グループは、まず、ヒトの遺伝子欠損変異に関わるマイクロホモロジーを探し出すため、「MHcut」を開発しました。MHcutはヒトゲノムデータと遺伝子の欠損や変異のデータベースを元に、DNA分子の両末端情報を整理し、遺伝子欠損変異に関わるマイクロホモロジーを選び出すことができます。MHcutで特定されたマイクロホモロジーは、ヒトのからだで起こりうる遺伝子欠損変異のうちの57%を占めていることが分かりました。

　次に、ヒトiPS細胞を用い、MMEJ機構を使ったゲノム編集技術CRISPR/Cas9を使って、遺伝子変異をもつ状態のiPS細胞を作製しました。筋ジストロフィーの代表的な原因遺伝子であるDYSF、赤血球産生に重要なヘム代謝系に関わる遺伝子であり、光線過敏症の原因遺伝子として知られるFECH遺伝子にそれぞれ変異を導入しました。

　DYSF遺伝子に変異を導入したヒトiPS細胞は筋細胞に、FECH遺伝子に変異を入れたヒトiPS細胞は赤血球に分化させ、それぞれ患者さんの細胞と比べました。すると、作製した細胞は患者さんの細胞と同じ表現型を示し、細胞の機能も同等であることが分かりました。

　患者さんの細胞から作製された疾患特異的iPS細胞は、細胞の入手に限界があります。例えば小児疾患は患者さんを探すのが困難です。今回、MHcut法とゲノム編集技術を用いて、ヒトiPS細胞から遺伝子疾患の病態を再現できました。今後、患者さんの細胞を使うことが難しい場合に病態モデルを作製する方法として期待ができます。

1. 論文名
   Genome-wide microhomologies enable precise template-free editing of biologically relevant deletion mutations
2. ジャーナル名
   Nature Communications
3. 著者
   Janin Grajcarek¹, Jean Monlong^2,3, Yoko Nishinaka-Arai¹, Michiko Nakamura¹, Miki Nagai¹, Shiori Matsuo¹, David Lougheed⁴, Hidetoshi Sakurai¹, Megumu K. Saito¹, Guillaume Bourque^2,4, and Knut Woltjen^*1,5
   *責任著者
4. 著者の所属機関
   1. 京都大学iPS細胞研究所（CiRA）
   2. Department of Human Genetics, McGill University
   3. UC Santa Cruz Genomics Institute, University of California
   4. Canadian Center for Computational Genomics
   5. 京都大学 白眉センター

本研究は、下記機関より資金的支援を受けて実施されました。

1. 公益財団法人 細胞科学研究財団
2. ケベック研究財団（カナダ）
3. 日本医療研究開発機構（AMED）
   再生医療実現拠点ネットワークプログラム
   疾患特異的iPS細胞を活用した難病研究「疾患特異的iPS細胞を活用した筋骨格系難病研究」
4. 日本医療研究開発機構（AMED）
   難治性疾患実用化研究事業
5. 日本医療研究開発機構（AMED）
   再生医療実現拠点ネットワークプログラム　iPS細胞研究中核拠点
6. 京都大学白眉プロジェクト

注1) ゲノム編集技術
人工 DNA 切断酵素によってゲノム DNA に DNA 二本鎖切断を誘導し、その修復過程において、標的遺伝子への欠失や挿入変異を導入（遺伝子ノックアウト）したり、ドナーベクターのゲノム DNA への組み込みを促進することで遺伝子を挿入（遺伝子ノックイン）したりする最先端の遺伝子改変技術。CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）は、Cas9というDNA切断酵素と、切断させたい場所へとCas9を誘導するガイドRNAを使い、ガイドRNAのターゲット配列を特異的に切断することができる。

注2) 相同組換え修復（homology directed repair；HDR）
DNAの塩基配列がよく似た部位（相同部位）で起こる組換えを利用した修復機構。

注3) 非相同末端結合（Non-Homologous End-joining ; NHEJ）
二本鎖切断の際、末端を直接繋ぎ合わせてDNA修復を行う機構。DNA末端の接合部において変異が起こりやすい

注4) マイクロホモロジー媒介末端結合（Microhomology-mediated end joining; MMEJ）
二本鎖切断の際に生じた切断両末端間で、相補的な配列同士が結合し、修復される機構。